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在生物(wu)學研究领域，單細胞分辨率的分析方法使研究人員能够发現細胞群體(ti)内(nei)的細微差异，避免因樣本平均值的掩盖而丢失具(ju)有(you)重要研究价值的信息。在衆多單細胞研究技術中，基於質(zhi)谱的單細胞蛋白質組(zu)學(SCP)因其能够(gou)直接檢測蛋白(bai)質分子而備受關注。進入近(jin)几年以(yi)來，SCP技術在檢測方法、樣本處理和(he)数據分析等環節都在持續優化改進(jin)，細胞通量指標也愈发提高，處理效率不断增強。
自2023年來，單細胞蛋(dan)白質組學技術SCP已能實現每個單細(xi)胞超過4,000種蛋白質檢測(ce)通量，在蛋(dan)白質定量(liang)分析领域取得了重要進展。目前SCP在(zai)實(shi)际應用中面臨的主要瓶颈在於樣本的細胞通量限製，这直接(jie)影響了其在大規模生物學研(yan)究中的推廣。與已(yi)經相当成熟的單細胞轉錄組測序技術相比(bi)，SCP文献中報道的平均(jun)捕获細胞数量少了兩個(ge)数量級，这反映了質谱(pu)檢測技術在樣本通量上仍需優化的空(kong)間。然而从生物(wu)學意義(yi)來看，蛋白質作為細胞功(gong)能的直(zhi)接分子载體，其在調(diao)控和執行細胞生命活動中的角色不可替代。由於(yu)蛋(dan)白質與RNA的表達量相關性较低，通過高通量轉錄組測序(xu)技術估算蛋白質(zhi)豐度的方法並不可靠，这使得直接測量單細(xi)胞内的(de)蛋白質豐度比仅測量RNA轉(zhuan)錄水平更具有生物學意(yi)義。
圖1. RNA並不能代表(biao)蛋白質的豐度(du)
从基於(yu)高通量(liang)測序的單細胞轉錄組學研究文献來看，该领域的共同核心可以簡化為(wei)三個基本研究策略：細(xi)胞注释(shi)、发育轨迹和(he)空間映射，这些策略已(yi)成為現代生物學研究的標準方法论框架。2024年7月，美國杨(yang)百翰大學研究團隊在國际學(xue)術期刊Journal of Proteome Research上发表研究文章，其主要目的是評估單細胞蛋白質組學技術目前是否(fou)已(yi)充分準備好應用於更廣泛的生物學基礎研究與應用领域。
圖2.評估單細胞蛋白質組學應用水平的三個研究策略
在生物(wu)學研究(jiu)中，从組織樣(yang)本(ben)經過酶解和機械分离后获得的單細胞悬液包含多種細胞類型，这些細胞需(xu)要(yao)進行精確的分類鉴定。與混(hun)合豆(dou)類混合物中通過顏色特征區分黄豆、綠豆、紅豆的原理(li)相同(tong)，單細胞注释是基(ji)於各細胞類型表達的特征基因進行的分類方法(fa)，使得檢測到的每一個細胞都能被準確(que)地分門別類(lei)。这一過程在單細胞水平(ping)上具有重要意(yi)義，直接影(ying)響后續的生物學分析結果。進行細胞注释通常需要參考細胞特征(zheng)基因(yin)数據库，其中CellMarker数據库(ku)作為常用的(de)參考资源，為(wei)不同組織、不同物種的各類細胞類型提供了系統的基因表(biao)達特征信(xin)息。SCP可以充分利用这些已有的公共数據库资源進行細胞類型注释工作。
圖3.SCP細胞注(zhu)释更細致和準確
為了給下游(you)分析提供有意義的注释(shi)，SCP需要足够的細(xi)胞通量和蛋(dan)白組學深度。但具體(ti)是(shi)多少呢？作者概括了在分析時必须考(kao)虑的几個因素：
捕获的細胞数量；
每個細胞的蛋白檢測(ce)深度；
批次效應；
Double-Dipping数據重复使用。
SCP分析所需的(de)細胞数量配置是一個复(fu)雜的參数化問題，涉及(ji)目標細胞(bao)類型的预期稀有性或浓度分布、樣(yang)本采集過程(cheng)中的脱落率、細胞存活率等(deng)多(duo)個影響因素。為了科學地確定采樣規模，研究人員通常以白(bai)細胞主要(yao)亚型的組成比例為參考模型，通過数(shu)學建模來演示細胞采樣量的估算方法。以典型的外周血白細胞分(fen)布為例(li)，在一份(fen)臨床樣(yang)本中，中(zhong)性粒細胞占比(bi)約62%、淋巴細胞約30%、單核細胞(bao)約5.3%、嗜酸性粒細胞約(yue)2.3%，而嗜(shi)碱性粒細胞(bao)仅占0.4%，構成了(le)明顯的細胞群體异質(zhi)性結構。若要確保最稀有的嗜碱(jian)性粒細胞能(neng)被充分注释和表征，需要設定合理的最(zui)小捕获阈值，即至(zhi)少获得5個(ge)该細胞類(lei)型的單細胞樣本。基於随機抽樣的概率论模型，要達成99%的統計學置信度，成功對(dui)最稀有細胞類型進(jin)行至少5次采樣，理论上需(xu)要捕(bu)获3,274個細胞。考(kao)虑到單細胞分選、轉運過程中不可避免的細胞损失，以(yi)及后續質控流程的嚴格(ge)過滤標準，業界通常预留約(yue)1%的损耗率作為缓冲，因此實(shi)际需要捕(bu)获至少3,308個細胞才能達成分析(xi)目標。
注：n表示細胞总数，x表示成功次数，k表示所需的最小成功次数，p表示成功事件的(de)概率，P表示(shi)总(zong)體概率
在細(xi)胞采集與質(zhi)控流程中，n代表實(shi)际細胞总数量，d代表質(zhi)控環(huan)節中細胞質量损失的百分比率，nadj則表(biao)示經過(guo)質控過滤后需要
細胞注释所需的蛋白質組學深(shen)度並不容易計算，这取決(jue)於目的細胞類型以及特征(zheng)蛋白的豐度。在單細(xi)胞蛋白(bai)質組學檢測實践中，SCP通(tong)常首先檢測到細胞内较豐富的(de)蛋白，因為在實际情况中被測蛋白是随(sui)機采(cai)樣的，高(gao)豐度蛋白更容易被(bei)儀器捕获和识別。随着檢測深度(du)的不(bu)断增加，SCP文献中逐步報道了更多(duo)的(de)中低豐度蛋白，使得細胞亚群的分(fen)類愈加精細(xi)。从細(xi)胞注释的基(ji)本原理來說，絕大部分情况是基於單個蛋白阳(yang)性或阴性進行的(de)判断，典型如CD4+T細胞(bao)的鉴定，其中CD4蛋白(bai)分子的豐度已經足够區分这個亚群(qun)。但(dan)少数特殊的細胞類型依靠低豐度蛋白進行(xing)注释，原因在於一方面这些細胞(bao)占比可能很低(di)，难以通過高豐(feng)度標志物识別，另一方面可能是蛋白本身表達(da)较低但(dan)在该亚群中特异性高。在公開的研究数據中，已經證實了基於蛋(dan)白表達的(de)細胞注释远比基於RNA的轉錄(lu)組注释更準確，尤其在注(zhu)释稀有細胞亚群時優(you)勢明顯。而(er)目前SCP覆(fu)盖的深度已達(da)4000+蛋白(bai)質，这(zhe)一覆盖廣度與scRNA-Seq的覆盖(gai)深度相当甚至超(chao)過，具體的深度效果取決於(yu)所采用的技(ji)術平臺、分析的細胞類型等多個因素。
許多基礎分析如細胞注释的前提是假設豐度值可以在樣本間(jian)進行比(bi)较。批次效應(ying)作為一種技術噪(zao)聲來源，會导致蛋白豐度產生偏移(yi)，令不同樣本的数(shu)據无法直接進行對標和分析。在單(dan)細胞(bao)蛋白質組學即SCP领域中，批次(ci)效應同樣是阻碍后續分析進度的關键难題(ti)。所幸的是，質谱(pu)檢測相比其他檢測(ce)手段具有明顯優勢，在實驗檢測条件保持稳定不變的情况下(xia)，可以通過添加内標或外標的方式來對樣(yang)品(pin)進行校準，从而有效消除樣本之間的蛋(dan)白豐度差(cha)异，使(shi)定量結果具有可比性。
生物體从胚胎時期的一個受精卵開始(shi)发(fa)育，細胞經历持續的分(fen)裂增殖來擴大種群数(shu)量，同(tong)時經历分(fen)化過程使其获得特定的生物學功能。免疫學领(ling)域的研究表明，T細胞系統包括(kuo)CD4+T細(xi)胞、CD8+T細胞(bao)等多種(zhong)亚型，这(zhe)些功能各异的T細胞(bao)均源自幼稚T細胞的(de)分化发育。在單細胞分辨率的觀察(cha)中(zhong)，生物體内正在(zai)发育的細胞群體展現出明顯的中(zhong)間分化阶段，呈現连續的細胞状態分布(bu)特(te)征，例如(ru)从幼稚(zhi)T細胞逐步向幼稚CD4+T細胞分(fen)化(hua)，再進一步分化為Treg細(xi)胞，这種細胞状態的连續演(yan)變過程被(bei)称為发育轨迹。
轨迹分析(xi)作為單細胞水平的特色分析手段(duan)，在(zai)細胞分化(hua)研究中具有重要意義。在scRNA-Seq数據分析中(zhong)，常用的(de)分析工具包括monocle2、GeneSwitch、PAGA等多(duo)種算(suan)法框架，这些工具的核心原理都是通過追蹤特征基因表達模式的動(dong)態改變來判断細胞在分化路径上的具體位置和发展(zhan)阶段。然而(er)，仅依赖轉錄層面的改變並不能完全代表蛋白(bai)豐度的實际變化情(qing)况，这一局限性在單細胞水平的研究中尤(you)為突(tu)出，因為(wei)單個細胞的蛋白翻译(yi)效率、蛋白稳定性等因(yin)素受多重調控影響。
將轨(gui)迹分析用於SCP，需要足够的細胞通量與合適的分析工(gong)具。下面(mian)概述了(le)在发育轨迹推断分析中 SCP 数據的三個重(zhong)要考虑因素：
捕获的細胞数量；
SCP 轨迹推断工(gong)具的可用(yong)性；
Double-Dipping数據重复使用。
如果轨迹的所有阶段同時出現在一個樣本中(zhong)（例如骨髓樣本中的造血細胞发育過程），那麼對樣本中的細胞進行充分采樣可(ke)以捕捉到所有的細胞发育状態，而这里(li)的"充分"采樣策略成為了實驗(yan)設計的關(guan)键環節。所需的(de)確(que)切細胞数量取決於三個重要因素，分別(bie)為構建轨(gui)迹的复雜性、過渡状態的数量以(yi)及細胞在每個(ge)发育状態下所花的時間。在製(zhi)定采樣策略時必须綜合考(kao)虑在发育的單個時刻、轨迹上以及生物學重复之(zhi)間(jian)如何有效捕捉細胞多樣性的方法。鉴於目(mu)前單細胞測序技術（SCP）的細胞通量相對有限的現状，在實际的實驗設計中需要在每条轨迹所需的細胞数量和轨迹重复實驗的次数之間進行精細(xi)的(de)權衡。重复的轨迹(ji)實驗可以帮助(zhu)研究人員確定轨迹的推断結構是否可靠，以及同一轨迹在多(duo)個樣本間(jian)是否具有可重复性和成立性，但当每条轨迹的細胞数量较少(shao)時可能导致轨迹推断的準確度随(sui)之下降。為了解(jie)決(jue)这一實驗設計难題，Boekweg等人開发了一(yi)個(ge)基於轨迹的功效分析框架，该框架通過計算機模擬了真(zhen)實實驗中的真正阳性发現率和假阳性发現率(lv)，為研究人員優化采樣和重复(fu)設計提供了量(liang)化依據（DOI: 10.1016/j.mcpro.2021.100085）。
圖 4. 在发育轨迹實驗(yan)中平衡每次重复的細胞(bao)数量和重复次数。例(li)如可以製作一(yi)個 200 個細胞的轨迹 (a)，或者可以(yi)製作四個 50 個細胞的轨迹 (b)。
目前常用的轨迹(ji)分析软件主(zhu)要是针對單細胞RNA測(ce)序技術開发的，这類工具在處理scRNA-Seq数據時具(ju)有成熟的算法框架，同時也(ye)可以適配包括空間轉錄組學在内的其(qi)他高通量測序数據類型。然而存在明顯的例外——RNA velocity分析方法通過精確計算未剪接RNA與已剪接(jie)RNA的(de)豐度比(bi)例，从而追蹤單(dan)細胞在发育分化過程中的動(dong)態轨迹。
空間(jian)映射技術(shu)通過在組織的空間層面進行原位分子檢測，實現對生物樣本微(wei)觀結構中(zhong)分子成分的精確定位與识別。在该领域的发展历(li)程中，最早應用的空間映射方法是免(mian)疫染色法，其基本原理是使用特定的染色(se)剂對組織切片進行分子標記(ji)，随后(hou)借助顯微镜對被標記的程度和具體位(wei)置進行逐一觀察。然而这一傳統方法存在明顯局限性，表現為檢測通(tong)量较低，同時(shi)容易受(shou)到分子特异性识別精度的製約。
目前，空(kong)間蛋白質組學采用兩種常(chang)见的實驗設計：MALDI 和LCM激(ji)光捕(bu)获顯微切割。这兩種技術都需要權衡数(shu)據采集速度和蛋白(bai)檢測深度。
圖5. 兩種蛋白質組學空間映射(she)技術的功(gong)能比较
在生物質量分析领域，MALDI 質谱(pu)成像技術擁有(you)相当深厚的應用基礎，其通(tong)過在原位進行樣本局部破坏以實現快速(su)的質谱檢測这一工作原理。然而该技術的固有特點決定了当在(zai)高空間分辨率条件下使用(yong)時，檢(jian)測灵敏度會(hui)随之降低，同時难以有效获取(qu)大量离子(zi)的 MS2 碎片离子信息，最終导致對(dui)蛋白(bai)質的檢測深度受到顯著限製。為了突破这一瓶颈，激光捕获顯微切割與質谱聯用(yong)技術(shu)（LCM-MS）應運而生，这一方法采用(yong)高精度激光从樣本中手動切割出(chu)單個目標區域，随后针對切割區域進行独立的蛋白質組學檢測和分(fen)析。
類比單細胞轉錄組測序與空(kong)間轉錄(lu)組學的分析思路，SCP平臺(tai)同(tong)樣具備對空間蛋白質組學数據進行空間映射的功能，可以通過多模態数據的整合分析來(lai)增強空間分群(qun)結果的準確性和可靠性。
樣本的分辨率；
樣本数量。
在(zai)對組(zu)織切片進行空間分析時，空間分辨(bian)率的選擇至關重要(yao)。LCM激光捕获顯微切割技術可以精確切出單(dan)個(ge)細胞，也能根(gen)據實际需求剪切出任意(yi)形状和大小的较大區域。这種灵(ling)活性(xing)為研究者提供了多層次的觀察手段。區域的大小直接影響分(fen)析結果的質(zhi)量，區域(yu)越大，所包含的(de)肽物(wu)質越多，進而產生的質谱信號就越強，使得檢(jian)測灵敏度相(xiang)應提高。
在空間轉錄組學和空間蛋白(bai)質組學等新興組學技(ji)術的應用中，获取的樣(yang)本(ben)数量和檢測規模是影響研究深度的重要參数。在空間轉錄組學领域，市售平臺已形成標準化體系，具有統一的空間分辨率和几何形(xing)状規範(fan)，其中10X Visium平(ping)臺作為應用最廣泛的商業(ye)解決方案，每张载(zai)玻片包含5,000個Spot的設計已(yi)成為行業參考標(biao)準。然而(er)，空間(jian)蛋白質組(zu)學作為相對新興的技術方向，商業化(hua)平臺数量仍然有限，因此實(shi)驗設計往往以適應特定的研究目的為主要导(dao)向，具有较大的自由度和定(ding)製(zhi)空間。青莲百奥基於多年的(de)技術积累，可為客戶提(ti)供全流程一站式的空間蛋白組(zu)學服務體系，涵盖从(cong)樣品準備、目標區域(yu)選取、蛋白檢測到数據分(fen)析(xi)的完整鏈路，针對不同研究需求提供個性化解決方案，既可接(jie)受OCT包埋樣本，也支持臨床常用的FFPE樣本處理。
過去十年，單細胞(bao)技術蓬勃发展(zhan)，各種方法可以(yi)越來越详細地表征 DNA、RNA 和蛋白質。基於(yu)質谱的單細胞蛋白質組學在生物學研究中具有(you)巨大潜力。上述三種研究策略（細(xi)胞注释(shi)、发育轨迹和(he)空間映射）均涉及權衡問題，除非 SCP 的細胞(bao)通量能(neng)大幅提高。在細胞注释中，包括所需捕(bu)获的細胞(bao)数量，以及如何設置實驗以使批(pi)次效應不會掩盖本身的(de)差异。在发育轨迹中，包(bao)括構建轨(gui)迹需要的細胞数量，以及生物學重复(fu)的(de)数量。在空間映射中，包括在樣本分辨(bian)率和所(suo)需樣本数量之間進行權衡。
參考文献：
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A foundational study in molecular biology quantification was published by Schwanhäusser and colleagues in Nature during May of 2011, specifically in volume 473, issue 7347, appearing on pages 337 through
Gray GK, Li CM, Rosenbluth JM, and colleagues published a comprehensive investigation into human breast tissue architecture by integrating single-cell proteomics and transcriptomics methodologies, which appeared in the journal Devel
